ELISPOT實(shí)驗(yàn)常見問題

1． 提取外周血淋巴細(xì)胞時(shí)，有那些注意事項(xiàng)？ 
答：如果取外周血淋巴細(xì)胞 (PBMC) 進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)，采用新鮮血液。在保證無菌操作的前提下，首先應(yīng)保證取血時(shí)抗凝劑應(yīng)及時(shí)充分的與血液混勻，避免血凝塊的出現(xiàn)。抗凝血及時(shí)提取PBMC，避免放置時(shí)間過長，室溫下避免overnight。應(yīng)選用分離效果好的淋巴細(xì)胞分離液，避免PBMC中混有過多其他細(xì)胞成分或雜質(zhì)。

2． 在分離外周血淋巴細(xì)胞時(shí)，發(fā)生了溶血，會(huì)影響我的試驗(yàn)結(jié)果嗎？ 
答：外周血出現(xiàn)溶血后，在使用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC時(shí)，溶血產(chǎn)生的細(xì)胞碎片、血紅素等雜質(zhì)將極大可能懸浮于分離液的層面，在吸取PBMC時(shí)非常容易混入這些雜質(zhì)，由于混入細(xì)胞的細(xì)胞碎片和血紅素很難清洗去除，在進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)時(shí)，有可能沉積在培養(yǎng)板底，嚴(yán)重影響細(xì)胞因子和抗體的結(jié)合，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3． 采用什么方法分離外周血淋巴細(xì)胞適合于ELISPOT試驗(yàn)？ 
答：使用專業(yè)的淋巴細(xì)胞分離液。進(jìn)口的如：Optiprep、Lymphoprep等。

4． 從動(dòng)物脾臟組織分離淋巴細(xì)胞應(yīng)如何操作？ 
答：取動(dòng)物脾臟組織時(shí)，應(yīng)注意取材的無菌操作。分離出脾臟組織，研磨后過200目篩網(wǎng)，保證所分離的細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞懸液。獲得細(xì)胞懸液后應(yīng)該使用相應(yīng)的淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)一步分離單個(gè)核細(xì)胞。

5． 在ELISPOT板上，每孔應(yīng)該放置多少數(shù)目的淋巴細(xì)胞？ 
答：在使用ConA，PHA等陽性刺激孔中，一般放置的淋巴細(xì)胞數(shù)為 104～2×105。在使用抗原作為刺激劑的情況下，每孔細(xì)胞濃度可在1～4×105。在使用多克隆刺激劑的情況下，應(yīng)適當(dāng)調(diào)低細(xì)胞濃度。但由于所用刺激劑的強(qiáng)度和批號(hào)不同，建議初次進(jìn)行ELISPOT檢測(cè)時(shí)，對(duì)刺激劑濃度和細(xì)胞濃度設(shè)立梯度，以保證較理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

6． 對(duì)淋巴細(xì)胞進(jìn)行：體外刺激預(yù)孵育、或板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)應(yīng)如何操作？ 
答： 將抗原和淋巴細(xì)胞在體外混合，刺激并預(yù)孵育，是通用的方法。預(yù)孵育的淋巴細(xì)胞，在置入ELISPOT板之前應(yīng)使用復(fù)溫到37℃的培養(yǎng)液清洗細(xì)胞1-2次。置入ELISPOT板以后通常在37℃培養(yǎng)5～6小時(shí)。 對(duì)于高度特異性抗原，可以采用將淋巴細(xì)胞和抗原同時(shí)加入ELISPOT板孔中，37℃培養(yǎng)箱中，同步進(jìn)行刺激、培養(yǎng)、和細(xì)胞因子捕獲。淋巴細(xì)胞板內(nèi)同步刺激培養(yǎng)的時(shí)間通常為22～24小時(shí)。

7． 在ELISPOT實(shí)驗(yàn)中刺激物應(yīng)如何選擇？ 
答：常用的非特異性刺激物有PMA/inomycin、PHA、Con A。根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)選擇上稍有稍有不同，一般而言：刺激小鼠細(xì)胞用Con A或者PMA/inomycin，刺激人 PBMC多用PHA。 特異性的刺激物主要有CEF、ICE（只能用于人）等多肽或者蛋白。具體的技術(shù)問題詳情垂詢。

8． 在使用抗原刺激淋巴細(xì)胞培養(yǎng)過程中，我發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液變黃，有什么影響？ 
答：這種現(xiàn)象通常見于使用很強(qiáng)的多克隆抗原刺激淋巴細(xì)胞，某些多克隆抗原會(huì)導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡或者死亡，大量淋巴細(xì)胞死亡后使培養(yǎng)液變黃。使用這些淋巴細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)ELISPOT試驗(yàn)通常得到很低的斑點(diǎn)（SPOT）形成。換用特異性抗原后可以避免該現(xiàn)象。

9． 在ELISPOT結(jié)果中出現(xiàn)：不規(guī)則的大塊斑點(diǎn)，有的區(qū)域沒有斑點(diǎn)是什么原因？ 
答：不規(guī)則斑點(diǎn)區(qū)域的出現(xiàn)一般是細(xì)胞分離不*所至，有時(shí)候采用多克隆抗原孵育的淋巴細(xì)胞也會(huì)產(chǎn)生成團(tuán)現(xiàn)象。請(qǐng)確認(rèn)加入到ELISPOT板中進(jìn)行孵育的是單細(xì)胞懸液。

10.關(guān)于培養(yǎng)基的選擇問題 
答：推薦使用無血清培養(yǎng)基（注意：是指專業(yè)的*培養(yǎng)基，不是不含血清的1640等基本培養(yǎng)基）如進(jìn)口的荷蘭U-Cytech公司生產(chǎn)的Lympho-SpotTM serum free medium等。當(dāng)然客戶也可以根據(jù)實(shí)際情況選用自備的1640培養(yǎng)基（含5%血清），但是血清帶來的干擾無法排除。