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游離蛋白S檢測試劑盒 （ADI）
更新時間：2014-12-08
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AAmerican Diagnostica GmbH,ADI 公司
Freee Protein S ELISA (Cat.no 842)中文說明書
（中文說明書供參考，請以英文說明書為準）
簡介，檢測原理（略）
試劑盒組成：
- 96孔板
- 2瓶Protein S 樣品稀釋液，即用型50ml
- 3瓶Protein S校準品
- 1瓶Protein S高值質控
- 1瓶Protein S低值質控
- 3瓶抗人Protein S-HRP 二抗
- Protein S二抗稀釋液（15ml）
- 1瓶，20X洗滌液(50ml)
- 1瓶TMB底物溶液 （25ml）
- 1瓶終止液（6ml）
試劑準備和保存
- 微孔板：鋁鉑拆開后，板條應該在30min內使用。不用的板條按2-8℃在原包裝袋內（含干燥劑）密封，防潮可保存4周。
- Protein S樣品稀釋液：即用型，一旦開蓋，2-8度可穩定4周。
- 校準品：每瓶校準品，用Protein S 樣品稀釋液2ml重懸。校準品含量相當于正常血漿1:50稀釋后的量。重懸后的校準品室溫（18-25℃）可保存8小時。
- Protein S Control I：用濾過的去離子水0.5ml重懸該質控品。重懸后的質控品室溫（18-25℃）可保存8小時，2-8℃可保存24小時，-20℃無菌條件可保存2月。
- Protein S Control II：用濾過的去離子水0.5ml重懸該質控品。重懸后的質控品室溫（18-25℃）可保存8小時，2-8℃可保存24小時，-20℃無菌條件可保存2月。
- Mab anti-Human Free Protein S-HRP：用4ml Protein S Conjugate Diluent，重懸該抗體。輕搖，重懸后的二抗室溫可保存24小時，2-8度可保存4周以上。
- Protein S Conjugate Diuent：即用型，開蓋后，2-8度可保存4周以上。
- Protein S Wash Solution：如果瓶內有沉淀或固體物質，37度水浴15-30min，輕搖瓶管，1:20用雙蒸水稀釋(50ml，稀釋后可制備1L的稀釋液)原管內2-8度保存，開蓋后后保存4周，稀釋后的稀釋液，2-8度可保存7天。
- TMB顯色底物：即用型，一旦開蓋，2-8度可保存4周以上。
- 終止液（0.45M H2SO4）：即用型。
樣品收集和制備
檸檬酸抗凝的血小板缺乏的血漿或血清適用于該實驗。
血漿按以下方式制備：
- 按血：檸檬酸鈉（3.2%）=9:1的比例，收集樣本
- 2500g 離心20min
- 血漿需2-8度保存，4小時內做檢測。或血漿保存于-20度，6個月內檢測。
- 凍的血漿需37度，迅速解凍。解凍的血漿2-8度保存，4小時內做檢測。
檢測的樣本和Protein S control需用protein S 樣品稀釋液1:50稀釋，如果樣品濃度可能高于100%，需做高濃度稀釋。如果樣本濃度x＜10%，樣本只需做小于1:50低濃度稀釋
校準品制備
Free Protein S 濃度以占血漿百分比（%）表示，。100% Free Protein S濃度相當于：正常血漿（混合池）1:50稀釋后的濃度。
按一下方式制備校準品：
Free Protein S（%） | C | C/2 | C/4 | C/10 | C/20 | 0 |
校準品加入量 | 1ml | 0.5 ml | 0.25 ml | 0.1 ml | 0.05 ml | 0 |
校準品稀釋液加入量 | 0 ml | 0.5 ml | 0.75 ml | 0.90 ml | 0.95 ml | 1.0 ml |
充分混勻，標準品稀釋液室溫穩定性至少4個小時（18-25℃）
操作流程：
- 依據做的標本數量，拆去多余的板條，置于提供的板條架上。
- 剩余檢測孔，按以下操作流程操作。
試劑 | 加入量 | 流程 |
Anti-Human Free Protein S-HRP | 100ul | 每孔加入100ul Anti-Human Free Protein S-HRP |
Protein S Standard diluted sample 或Protein S sample diuent(blank) | 100ul | 立即加入100ul ProteinS 標準品和檢測樣本至對應孔 |
室溫（18-25℃）孵育1小時（手動輕震板或振板器振板） | ||
Protein S 稀釋液 | 300ul | 洗板5次 |
TMB底物顯色液 | 200ul | 洗滌完畢后，立即每孔加入200ul底物顯色液 |
室溫（18-25℃）孵育5min() | ||
0.45M H2SO4 | 50ul | 加入0.45M H2SO4終止液 |
等待10min待顏色穩定，450nm測定吸光度，減去空白吸光度。 | ||
注意：
- 在孵育的時候，特別是顯色的時候，避免微孔板強光照射。
- 在加入試劑前或洗滌前，不要使板干透。隨后加入的時間應在3min內完成，避免微孔板太干燥。如果已干燥，在加入新試劑前，需加入洗滌液，然后去掉。
- 每排板孔，加入TMB底物的時間間隔需要測定。終止時間要相同
結果：
以Protein S 標準品濃度（%）做橫坐標，平均吸光度做縱坐標，每次檢測都需要重新做標準曲線，如圖所示。
計算：
從曲線可直接計算出ProteinS 的濃度（樣品按：1:50稀釋）。如果樣品做了高濃度的稀釋，需乘以對應稀釋系數D(例如：樣本做了1:100稀釋后，測值需乘以2，1:200稀釋后，測值需乘以4) 。如果做低濃度的稀釋，得到的檢測值需除以稀釋倍數。
檢測程序的局限性：
因為盒子內的單抗是鈣依賴性單抗，所以請用盒子里自帶的Wash Buffer (含鈣)。如果洗滌不充分，得到的樣品檢測OD值會很高，為避免非特異性顯色，請確保洗滌的充分性。
測值：
血漿中Protein S 濃度正常值：60-150%，因此非正常值＜60%。一般男性測值會高于女性，且隨年齡和血脂濃度增加。
