細胞培養(yǎng)中的支原體污染的預防及處理

Mycoplasma國內(nèi)主要有三種譯名，醫(yī)學文獻譯為“支原體”（分枝原體，枝原體，類菌質(zhì)體），動物醫(yī)學文獻譯為“霉形體”或“支原體”，中國臺灣、香港則譯為微漿菌。

支原體是目前已知一類能在無生命培養(yǎng)基上生長繁殖的zui小的原核細胞型微生物。自然界分布廣泛，種類多，有80余種，分為兩個屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。與人類感染有關的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。

支原體無細胞壁，多呈不規(guī)則球狀、長絲狀，可分枝，營寄生共生或腐生。一般侵害對象為動植物，可造成多種疾病。

細胞培養(yǎng)（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。國內(nèi)外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和菜氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國外調(diào)查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。

支原體污染的來源包括工作環(huán)境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養(yǎng)基的污染、被污染細胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細胞的原始組織或器官的污染，等等。

體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質(zhì)沒有抵抗能力，因此培養(yǎng)基應達到無化學物質(zhì)污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產(chǎn)生損傷作用的生物活性物質(zhì)污染（如抗體、補體）。對于天然培養(yǎng)基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養(yǎng)基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。

由于體外培養(yǎng)細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養(yǎng)基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養(yǎng)細胞一旦發(fā)生污染多數(shù)將無法挽回。支原體污染后，因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞手到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長等。

組織細胞培養(yǎng)工作中，可以從以下幾方面來預防支原體的污染：控制環(huán)境污染；嚴格實驗操作；細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；在細胞培養(yǎng)基沖加入適量的抗生素。

抗生素主要用于消毒培養(yǎng)液，是培養(yǎng)過程中預防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應根據(jù)需要選擇。

在細胞培養(yǎng)過程中如果發(fā)現(xiàn)破碎的細胞甚多，培養(yǎng)細胞需要頻繁改善營養(yǎng)環(huán)境才能支持長期傳代培養(yǎng)時，應該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養(yǎng)液也不渾濁。

支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。要注意的是：支原體沒有細胞壁，故作用于細胞壁生物合成的抗生素，如內(nèi)酰胺類、萬古霉素等是不敏感的；對多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐火物。對支原體zui有抑制活性抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類等，氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小的抑制作用。必要時更換所有培養(yǎng)用物。通常，濾過除菌的方法對支原體是沒有作用的。

由于一些微生物，如支原體，病毒等能通過濾膜，所以過濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險，近年來，60Co輻射滅菌技術在醫(yī)藥、食品等領域廣泛應用，由于輻射滅菌能夠*殺滅所有微生物。有試驗證實以2Mrad輻射處理的各培養(yǎng)基樣品達到了無菌要求，經(jīng)多批培養(yǎng)試驗，輻射滅菌安全可靠；輻射滅菌的培養(yǎng)基營養(yǎng)性能不低于過濾組，證明輻射滅菌對培養(yǎng)基性能無不良影響；對血清的輻射滅菌試驗效果也表明60COγ射線不影響培養(yǎng)效果。把干粉培養(yǎng)基經(jīng)無菌操做定量分裝于滅菌容器內(nèi)，輻射后以干粉原型貯藏，不但培養(yǎng)基的純凈性得到保障，而且營養(yǎng)性能較過濾后以水溶液形式保存更穩(wěn)定，對谷氨酰胺等這類水溶液不穩(wěn)定者特別合適。

目前，有專門做支原體檢測的試劑盒，可以用細胞滴片檢測。市場上已有了新一代支原體抗生素M-Plasmocin（InvivoGen公司），能有效的殺滅支原體，又不影響細胞本身的代謝，而且處理過的細胞不會重新感染支原體。另外，配合支原體檢測試劑盒（市場上有售，如美國ICN公司的產(chǎn)品），可以幫助盡快發(fā)現(xiàn)支原體的污染。