逆行神經示蹤-熒光金操作流程

熒光金（Fluoro-Gold）操作流程

1.背景簡介

熒光金（Fluoro-Gold）的使用與熒光示蹤劑基本相同。主要區別在于熒光金注射后存活時間、濃度范圍、組織處理及其他組織學技術的兼容性方面更靈活。

2.保存和效期：

熒光金干粉需要4℃避光保存。按要求保存，效期可超過1年。溶解后的熒光金也應4℃避光保存，溶解后效期至少6個月。

3.溶解

 熒光金可以溶解于蒸餾水或0.9%生理鹽水中或作為懸浮液于0.2mol/L的中性磷酸鹽緩沖液中。

4.染料濃度

熒光金濃度1-10%被廣泛應用并取得良好效果。建議起始濃度4%。如果注射部位出現壞死或標記過于強烈，請將濃度降低至2%。如果需要更精確的定量，可參照熒光金分子量532.6Da計算。

5.熒光金注射

A. 壓力注射：壓力注射是常用的注射方式。注射體積一般1-2ul。

B．離子電滲法：用脈沖電流（打開4-10S，關閉4-10S）1-5A在10-20分鐘。

C．晶體-示蹤劑的晶體可以從微量移液管的頂端給藥。

6.術后生存期

熒光金注射后觀察到的逆行標記為2天到2個月。典型的熒光金存活期為3-5天。較長的存活期可增強遠端突起的填充，而不會使染料從細胞中擴散。

7.固定

幾乎任何固定劑或沒有固定劑都可以使用；常用含有4%甲醛的磷酸鹽中性緩沖液固定。含有高濃度重金屬（如鋨、汞）的固定劑會淬滅熒光，而高濃度（超過1%）的戊二醛可能會增加背景熒光。

8. 切片處理：

含有熒光金的組織，可以根據幾乎任何組織學檢測進行后續操作。包括固定組織的低溫恒溫切片（10um）、固定組織的冷凍切片（20um）或石蠟包埋（3-10um）組織切片等。冰凍組織切片是常用的。

9. 組合檢測方法：

組織切片可以進一步處理，通過第二標記檢測，包括：放射自顯影，HRP組化染色、免疫細胞化學或第二示蹤劑染色或熒光復染等。

10.封片，透明，蓋片

切片用明膠包被，風干，浸入二甲苯溶液中，用DPX非熒光封片劑封片。如果與第二示蹤劑不兼容，可以選擇梯度酒精脫水。如果熒光金與細胞熒光結合檢測，切片風干，直接用中性甘油緩沖液（1:2）封片。

11. 檢測

熒光金可以通過寬紫外激發濾光片的熒光金顯微鏡觀察。當組織用中性pH緩沖液處理時，會發出金色光。當組織用酸性緩沖液（如pH3.3）處理時，則會發出藍色。可以使用數碼或膠片拍攝（彩色打印使用200-400 ASA film，黑白打印使用類膠片如：TRI-X）。大多數曝光時間為：10-60秒，具體取決于物鏡放大倍數和標記強度，30秒曝光時間為平均值。可以通過多次曝光來同時顯示熒光金和另一種示蹤劑。因此，紫外線與亮場結合，在放射自顯影中同時定位熒光金和HRP 或銀顆粒。同樣，藍光激發也可以結合FTIC，而綠色激發光可以同時觀察碘化丙啶或溴化乙錠（一種熒光復染劑）的紅色。

其它關于熒光金應用信息：

注射方法：

對于使用微量注射器或微量移液器進行的壓力注射，熒光金應溶解在蒸餾水或0.9%的生理鹽水中。熒光金也可以用0.2M的中性磷酸緩沖液制作成懸浮液，但是懸浮顆粒可能會堵塞移液器頂端，因此蒸餾水或0.9%的生理鹽水是優選的稀釋液。對于離子電滲法，在1M醋酸鹽緩沖液（pH3.3）中配置1%熒光金溶液。較好的（經過95%乙醇，水清理）移液管頂端因為10-20um。最佳的離子電滲法參數是：用脈沖電流（打開4-10S，關閉4-10S）1-5A在10-20分鐘。

注射位點：

幾乎任何中樞或外周神經神經系統結構都可以注射熒光金來進行逆行示蹤研究。在外周神經系統中，可以研究神經節和外周靶點。對于周圍神經的研究，應切割或損傷神經，并將其浸入或注射5%的熒光金溶液。由于熒光金不會被完整的通道纖維顯著吸收，因此必須切割或嚴重損壞纖維才能吸收染料。

熒光金運輸和存活時間：

盡管發生了順向軸突運輸，但是熒光金被用作逆向軸突示蹤劑。存活時間是不同的（特別對非常短的存活時間12小時-2天），以最大限度的提高所研究的特定神經元系統中的順向運輸。對于逆行運輸，存活時間從4天到14天不等。對于大多數系統來說，7-14天是有效的。盡管長通路（如脊髓到腦干）和大型哺乳動物（如貓，猴子）的通路可能需要更長的存活時間（如14天）。此外，由于熒光金在逆行標記的神經元內保持快速輸送，幾個月的存活時間也會產生好的結果。對于離子電滲法，建議存活2-5天。據統計，哺乳動物的運輸速度為每天2cm，對于冷血動物來講，速度較慢。

組織處理：

組織處理在使用指南和最早出版物中有詳細介紹(Schmued and Fallon, 1986, Brain Research 377:147-154)。由于熒光金在許多溶劑中非常穩定，并且在逆行標記的神經元中保持快速輸送，因此其應用與很多組化技術相兼容。它可以與其他逆行示蹤劑、免疫熒光、PAP和ABC免疫細胞化學、HRP組化染色、放射自顯影、復染（溴化乙錠是優選的熒光復染物）、石蠟包埋和塑料包埋一起使用。然而，如果組織未固定，在水溶液中對組織進行額外處理超過1-2小時，將導致標記神經元的熒光金熒光損失。熒光金在電子顯微鏡中可能很有用。熒光金可用于大腦切片（已轉移到磷酸鹽緩沖液中）。切片通常用明膠包被，風干，進入二甲苯中，并用DPX封片劑封片。組織也可以在載玻片上觀察，無需進一步處理。可以用梯度醇進行脫水，或者對于免疫細胞組化，切片可以風干，用中性甘油緩沖液（1:2）封片。

檢測和拍照：

熒光金通過寬帶紫外線（UV）激發熒光顯微鏡濾光片觀察。使用與寬帶紫外線下激發的其他熒光示蹤劑（如True Blue, Fast Blue, Nuclear Yellow）相同的濾光片包，如：Leitz Phloem filter system A (Wide Band UV, Excitation filter BP 340-380), Mirror RKP 400, Barrier Filter LP 430)。由于塑料會吸收紫外線，因此不建議通過塑料培養皿進行觀察。推薦膠片T-Max (Kodak, black & white) and Ektachrome 200 Kodak, color slides)，曝光時間從20s到1.5min不等。

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